In seguito alle diverse prove effettuate per la fase di ottimizzazione del protocollo di preparazione dei campioni di grano ed in base ai risultati conseguiti, le seguenti operazioni sono state ritenute le più adatte per preparare i campioni da sottoporre all’analisi NMR:

• un’aliquota di 300 mg di campione macinato per 1 minuto e setacciato è stata pesata all’interno di un tubo da centrifuga, utilizzando una bilancia analitica (grado di precisione 0.0001g);
• 3 mL di una soluzione tampone [(HC2O4)-/(C2O4)2- = 0.25 M] a pH=4.2 contenente sodio azide (NaN3 = 2.5 x 10-3 M, CAS N. 26628-22-8; ≥99.5%, Sigma-Aldrich, Milan, Italia) è stata addizionata all’aliquota di campione;
• il campione è stato sottoposto a sonicazione mediante bagno ad ultrasuoni a 40 KHz per 10 minuti a 60°C;
• il campione è stato sottoposto ad agitazione meccanica mediante Vortex (Advanced Vortex Mixer ZX3, VELP Scientifica Srl, Italia) a 2500 impulsi per 5 minuti;
• la miscela è stata sottoposta a centrifugazione a 6000 rpm per 10 minuti;
• il surnatante è stato trasferito in nuove provette e pastorizzato per 10 minuti in un bagno a 90°C per bloccare l’attività enzimatica;
• la soluzione pastorizzata è stata filtrata mediante l’impiego di un filtro-siringa in politetrafluoroetilene (PTFE, 0.2 µm, LLG-Labware) e trasferita all’interno di vial ambrato (2 ml) dotato di un tappo con un setto pretagliato;
• il vial è stato alloggiato all’interno dell’attuatore Bruker SamplePro mediante il quale il tubo NMR (Norell 509-UP 7) è stato riempito automaticamente, dosando e miscelando i seguenti volumi: 630 µl di estratto e 70 µl di una soluzione allo 0.2 wt% di sale sodico dell’acido 3-(trimethylsilyl)-2,2,3,3-tetradeutero-propionico (TSP, CAS N. 24493-21-8, 99 %D, Armar Chemicals, Döttingen, Switzerland) in acqua deuterata (D2O, CAS. N. 7789-20-0, 99.86 %D, Eurisotop, Saclay, France);
• il tubo NMR è stato trasferito in un alloggiamento dell’autocampionatore comunicante con lo spettrometro NMR (Bruker Avance 400 MHz);
• acquisizione dello spettro 1D 1H NOESY NMR.

Il protocollo descritto è stato impiegato per la preparazione di 318 tubi NMR (2 replicati per ciascun campione), etichettati mediante un barcode univoco. Per la preparazione dei campioni NMR di pane, questo prodotto è stato sottoposto ad un processo di essicazione di 48 ore prima di applicare il presente protocollo di estrazione.

Parametri di acquisizione dell’analisi 1D 1H NOESY NMR

I campioni preparati secondo la procedura descritta nel paragrafo X sono stati sottoposti ad un’analisi 1D 1H NOESY NMR mediante lo spettrometro Bruker Avance I 400 MHz (Bruker, Germania) dotato del probe BBI 5-mm. Gli spettri sono stati acquisiti in automazione a 298.1 K, impostando i seguenti parametri ottimizzati:

• sequenza di impulsi: NOESY monodimensionale con pre-saturazione del segnale del solvente (H2O, 4.70 ppm) con gradienti Z (noesygppr1d);
• tempo di acquisizione digitale: 64k (′TD = 65536) che equivale a 4.09 secondi (′AQ′);
• ampiezza spettrale: 20 ppm (′SW = 20′);
• offset del trasmettitore: 4.70 ppm (′O1P = 4.7′) corrispondente al segnale residuo dell’acqua;
• dummy scans: 4 (′ds = 4′);
• numero di scansioni: 64 (′ns = 64′);
• mixing time: 10 ms (′d8 = 0.01′);
• recycle delay: 10 s (′d1 = 10′);
• receiver gain: 128.

Preparazione dello spettrometro NMR all’acquisizione

Prima dell’acquisizione degli spettri dei campioni sono state regolate le shim per ottimizzare l’omogeneità del campo magnetico mediante un tubo NMR contenente lo standard fornito dalla casa costruttrice dello spettrometro. Lo standard usato consiste in una soluzione di saccarosio (2.0 mM) e sale sodico dell’acido 4,4-dimetil-4-silapentane-1-sulfonico (DSS, 0.5 mM) in H2O/D2O (9/1) (99.9 atom %D). L’omogeneità del campo magnetico è stata ottimizzata mediante procedura automatica (‘topshim gui’). Uno spettro 1D 1H NOESY NMR della soluzione standard è stato registrato utilizzando la stessa sequenza di impulsi (′noesygppr1d′) prevista per i campioni di grano e di pasta. La larghezza a mezza altezza del segnale del TSP è stata misurata ed è stato verificato che il suo valore fosse inferiore a 1.5 Hz. I parametri dell’omogeneità del campo magnetico sono stati memorizzati (′wsh′) e utilizzati per le successive analisi NMR dei campioni.

Di seguito viene riportata la sequenza di operazioni effettuate in automazione (in parentesi sono riportati i comandi utilizzati mediante spettrometro Bruker Avance 400 MHz) su ciascun campione analizzato:

1. inserimento del campione nello spettrometro;
2. creazione di un nuovo set di parametri per il programma di impulso (′noesygppr1d′);
3. stabilizzazione della temperatura a 298 ± 0.1 K per almeno 5 min;
4. lock dello spettrometro al segnale del solvente deuterato utilizzato durante la preparazione del campione (D2O);
5. sintonizzazione del probe mediante la procedura automatica di tuning e matching (′atma′);
6. richiamo dei valori delle shim inizialmente ottimizzati sullo standard di saccarosio (′rsh′);
7. ottimizzazione automatica del campo magnetico sul campione mediante regolazione automatica delle Z-shim (′topshim′);
8. ottimizzazione automatica della durata dell’impulso p1 (impulso 90°);
9. calcolo del livello di potenza per l’impulso di presaturazione dell’acqua a 4.7 ppm (′pulse 25Hz′) parametro pl9;
10. acquisizione del FID per ciascun campione (′zg′);
11. a seguito dell’acquisizione del FID ed esecuzione della trasformata di Fourier (′efp′), è stata verificata la larghezza del segnale del TSP a metà altezza (′hwcal′). Nel caso in cui tale valore è risultato superiore a 1.5 Hz le shim sono state riottimizzate e l’analisi NMR è stata ripetuta.

Istruzioni operative per l’elaborazione degli spettri 1D 1H NOESY NMR

Gli spettri risultati dall’analisi NMR sono stati processati ed elaborati utilizzando il software MestReNova 11.0 (Mestrelab Research SL, Santiago de Compostela, Spagna). Le operazioni effettuate sono state le seguenti:

• correzione manuale della fase;
• correzione automatica della linea di base
• Method: Bernstein Polynomial Fit.
• Polynomial Order:1

allineamento dello spettro sul segnale a 0 ppm del TSP-d4 (sale sodico dell’acido 3-(trimethylsilyl) -2,2,3,3-tetradeutero-propionico) usato come composto di riferimento interno.